Kuidas need endonukleedid eristuvad?
Kui palju te teate restriktsiooniensüümide kohta? Selle ülevaate saamiseks saate paremini mõista, mida nad teevad ja miks nad on olulised.
Restriktsiooniensüümide määratlemine
Piiratud endonukleaase on ensüümi klass, mis lõikab DNA molekule. Iga ensüüm tuvastab nukleotiidide unikaalse järjestuse DNA ahelas. Sellised järjestused on tavaliselt umbes 4-6 aluspaari pikkused. Järjestused on palindroomsed, kuna komplementaarne DNA ahel on sama järjestusega ainult vastupidises suunas.
Teisisõnu lõigatakse mõlemad DNA-kiud ühes kohas.
Kust neid fermente leidub
Piiratud ensüüme leidub paljude erinevate bakterite tüvedes, kus nende bioloogiline roll on osaleda rakkude kaitses. Need ensüümid "piiravad" väliselt (nt viirus) DNA-d, mis siseneb rakku, hävitades selle. Peremeesrakul on restriktsiooni modifitseerimise süsteem, mis metüleerib oma DNA vastavate restriktsiooniensüümide spetsiifilistel kohtadel, kaitstes seega selle lõhustumisest. On leitud üle 800 teadaoleva ensüümi, mis tunnevad ära enam kui 100 erineva nukleotiidjärjestuse.
Kasutamine biotehnoloogias
Piiratud ensüüme kasutatakse biotehnoloogias, et lõigata DNA väiksematesse ahelatesse, et uurida üksikisikute fragmentide pikkuse erinevusi (piirangute fragmendi pikkuse polümorfism - RFLP). Neid kasutatakse ka geenide kloonimiseks.
RFLP-meetodeid on kasutatud selleks, et teha kindlaks, et indiviididel või indiviidide rühmadel on geenijärjestustes ja restriktsiooni lõhestamisprotseduurides erinevusi genoomi teatud piirkondades.
Nende ainulaadsete alade tundmine on DNA sõrmejälgede võtmise alus. Igaüks neist meetoditest sõltub DNA fragmentide eraldamiseks agaroosgeeli elektroforeesi kasutamisest. DNA-toodete uurimiseks kasutatakse sageli agaroosgeel- elektroforeesi TBE puhvrit, mis koosneb Tris-alusest, boorhappest ja EDTA-st.
Piirangutega ensüümide tüübid
On kolm erinevat tüüpi restriktsiooniensüüme. Tüüp I lõikab DNA-d juhuslikes kohtades kuni 1000-st või enamast aluspaarist tunnustamiskohast. III tüüpi jaotustükid said umbes 25 baaspaari. I ja III tüübid vajavad ATP-d ja võivad olla suured ensüümid, millel on mitu allühikut. II tüüpi ensüümid, mida peamiselt kasutatakse biotehnoloogias, lõigatakse DNA tunnustatud järjestuses ilma ATP-i vajaduseta ning on väiksemad ja lihtsamad.
II tüüpi restriktsiooniensüümid on nimetatud bakteriliikide järgi, millest nad on eraldatud. Näiteks eraldati E. coli ensüüm EcoRI. Enamik üldsust tunneb E. coli haiguspuhanguid toidus.
II tüübi restriktsiooniensüümid võivad tekitada kahte erinevat tüüpi jaotustüki sõltuvalt sellest, kas nad lõikavad mõlemad kiud tunnustusjärjestuse keskel või mõlemad kiud tuvastamisjärjestuse ühe otsa lähedale.
Endine lõikamine loob "nürid otsad", millel pole nukleotiidilaiendeid. Viimane tekitab "kleepuvaid" või "sidusaid" otsasid, kuna iga saadud DNA fragmendil on üleripp, mis komplitseerib teisi fragmente. Mõlemad on kasulikud rekombinantse DNA ja valkude moodustamisel molekulaargeneetikas.
See DNA-vorm eristub, kuna see tekib kahe või enama erineva kihi ligeerimisega (ühendamine koos), mis ei olnud algselt omavahel seotud.