Geeni kloonimine on ühe geeni koopiate või kloonide tegemine. Kui geen on identifitseeritud, saab kloone kasutada paljudes biomeditsiini- ja tööstusuuringutes. Geneetiline tehnika on geenide kloonimise protsess uuteks organismideks või valgusaaduse muutmiseks DNA järjestuse muutmine. Geneetiline tehnika sõltub meie võimest järgmistest olulistest protseduuridest teha.
01 polümeraasi ahelreaktsioon
Restriktsiooniensüümid
Valkude kujundamiseks on olulised restriktsiooni endonukleaaside tuntud ensüümide avastamine. Need ensüümid lõigasid DNA-d konkreetsetes kohtades, mis põhinevad nukleotiidjärjestusel. Paljudest erinevatest bakteritüvedest on eraldatud sadu erinevaid restriktsiooniensüüme , mis on võimelised DNA-d lõikama erinevates kohtades. Piiratud ensüümiga lõigatud DNA tekitab palju väiksemaid, erineva suurusega fragmente. Neid saab eraldada geelelektroforeesi või kromatograafia abil.
03 elektroforees
DNA puhastamine rakukultuuridest või selle lõikamine restriktsiooniensüümide abil ei oleks eriti kasulik, kui me ei suudaks DNA-d visualiseerida - see tähendab, et leida viis, kuidas teie ekstrakt sisaldab midagi või mis teie suurus sisaldab lõigates selle sisse. Üks võimalus seda teha on geel-elektroforees. Geeli kasutatakse mitmesugustel eesmärkidel, vaadates lõigatud DNA-d, et tuvastada DNA inserte ja knockouts.
04 ühinege kahe DNA-ga
Geneetilistes uuringutes on sageli vaja seostada kaks või enam DNA üksikut ahelat rekombinantse ahela loomiseks või sulgeda restriktsiooniensüümidega lõigatud ringikujuline ahel. Ensüümid, mida nimetatakse DNA ligaasideks, võivad luua kovalentseid sidemeid nukleotiidide ahelate vahel. Selles protsessis on samuti tähtsad ensüümide DNA polümeraas I ja polünukleotiid-kinaas 5-otsa lünkade täitmiseks või fosforüülimiseks.
05 Väikese isepärtuliku DNA valimine
Väiksed ringikujulised DNA tükid, mis ei kuulu bakteriaalsesse genoomi, kuid on võimelised ise replitseeruma, on tuntud kui plasmiidid. Mikrogeensete geenide transportimiseks kasutatakse vektoreid sageli plasmiide. Kui biotehnoloogias on pärast huvipakkuva geeni amplifitseerimist ja nii geeni kui ka plasmiidi lõigatakse restriktsiooniensüümidega, siis nad ligeeritakse kokku, tekitades rekombinantse DNA nime. Viiruslikku bakteriofaagi DNA-d võib kasutada ka vektorina, nagu ka kosmiidid, bakteriofaagi geene sisaldavate rekombinantsete plasmiididega.
06 meetod vektori liigutamiseks peremeesrakku
Geneetilise materjali ülekandmist vektorisse, nagu plasmiid, uutele peremeesrakkudele, nimetatakse transformatsiooniks. See meetod eeldab, et peremeesrakud puutuvad kokku keskkonna muutustega, mis muudavad nad vektorist "pädevaks" või ajutiselt läbilaskvad. Üks selline meetod on elektrotatsioon. Mida suurem on plasmiid, seda madalam on efektiivsus, millega rakud asuvad. Suuremad DNA segmendid kloonitakse kergemalt bakteriofaagi, retroviiruse või teiste viirusvektorite või kosmiidide abil transduktsiooni meetodil. Faagilisi või viirusvektoreid kasutatakse sageli regeneratiivses meditsiinis, kuid see võib põhjustada DNA sisestamist meie kromosoomide osades, kus me seda ei soovi, põhjustades tüsistusi ja isegi vähki.
07 Transgeensete organismide valimise meetodid
Mitte kõik rakud ei võta transformatsiooni ajal DNA-d. On oluline, et oleks olemas meetod nende tuvastamiseks, mis seda teevad. Üldiselt sisaldavad plasmiidid antibiootikumiresistentsuse geene ja transgeenseid rakke saab valida nende geenide ekspresseerimise ja nende võimet kasvada selle antibiootikumi sisaldavas söötmes. Alternatiivsed selektsioonimeetodid sõltuvad teiste reportervalkude, nagu x-gal / lacZ- süsteemi või rohelise fluorestsentsvalgu olemasolust, mis võimaldavad valida vastavalt värvi ja fluorestsentsi.