PCR-i protsess, mis on välja töötatud 1983. aastal, on võimaldanud teostada DNA sekveneerimist ja identifitseerida nukleotiidide järjestust üksikutes geenides.
Meetod kasutab termilist tsüklit või reaktsiooni korduvat kuumutamist ja jahutamist DNA sulamisel ja replikatsioonil. Nagu PCR jätkub, kasutatakse "uut" DNA replikatsiooniks mallina ja seepärast järgneb ahelreaktsioon, eksponentsiaalselt amplifitseerides DNA malli.
PCR-meetodeid kasutatakse paljudes biotehnoloogia valdkondades, sealhulgas proteiinide , kloonimise, kohtumeditsiini (DNA sõrmejälgede võtmine), isadustestide, pärilike ja / või nakkushaiguste diagnoosimise ning keskkonnaproovide analüüsi.
Eelkõige eksperthinnangus on PCR eriti kasulik, kuna see võimendab isegi kõige väiksemat DNA-tõendusmaterjali. PCR-i saab kasutada ka tuhandete aastate DNA analüüsimiseks, ja neid meetodeid on kasutatud selleks, et teha kindlaks kõik, mis pärineb 800 000-aastasest mammutist kuni muumiateni kogu maailmast.
PCR-protseduur on järgmine:
- Initsialiseerimine: See etapp on vajalik ainult DNA polümeraaside jaoks, mis vajavad kuuma käivitamise PCR-i. Reaktsioonisegu kuumutatakse temperatuuril 94 kuni 96 ° C ja hoitakse 1-9 minutit.
- Denatureerimine: kui protseduur ei vaja lähtestamist, on esimene samm denatureerimine. Reaktsioonisegu kuumutatakse temperatuuril 94-98 ° C 20-30 sekundit. DNA malli vesiniksidemed on häiritud ja luuakse üheahelalised DNA molekulid.
- Annealing: reaktsioonitemperatuur on madalam temperatuurivahemikus 50-65 ° C ja hoitakse 20-40 sekundit. Praimerid lõpevad üheahelalise DNA matriitsiga. Selles etapis on temperatuur väga oluline. Kui see on liiga kuum, võib praimer seostuda. Kui see on liiga külm, võib praimer seostuda ebatäiuslikult. Hea side tekib siis, kui praimerjärjestus sobib täpselt matriitsjärjestusega.
- Pikendamine / pikenemine: selle etapi temperatuur erineb sõltuvalt polümeraasi tüübist. DNA polümeraas sünteesib täiesti uue DNA ahela.
- Lõplik pikenemine: See etapp viiakse läbi temperatuuril 70-74 ° C 5-15 minutit pärast lõplikku PCR tsüklit.
- Lõpptähtaeg: see samm on vabatahtlik. Temperatuuri hoitakse temperatuuril 4-15 ° C ja langeb reaktsioon.
Menetlus on jagatud kolmeks etapiks:
- Eksponentsiaalne võimendus: iga tsükli jooksul kahekordistub toode (konkreetne DNA-tükk, mida korratakse).
- Tasanduslävi: Kuna DNA polümeraas kaotab aktiivsuse ja tarbib reaktiive, siis reaktsioon aeglustub.
- Plateau: rohkem toodet ei kogune.