DNA järjestamine sõltub ka meie võimest kasutada geelelektroforeesi, et eraldada erineva suurusega DNA ahelaid nii vähe kui üks aluspaar.
DNA järjestamine
1970-ndate aastate lõpul leiti kaks DNA järjestamise tehnikat pikemateks DNA molekulideks. Need olid Sangeri (või dideoksü) meetod ja Maxami-Gilberti (keemilise lõhustamise) meetod. Maxam-Gilberti meetod põhineb nukleotiidide spetsiifilisel lõhustamisel kemikaalidega ja seda saab kõige paremini kasutada oligonukleotiidide (lühikesed nukleotiidpolümeerid, tavaliselt väiksemad kui 50 aluspaari pikkuses) järjestamiseks. Sangeri meetodit kasutatakse sagedamini, kuna seda on tehniliselt kergemini rakendada ning PCR-i tulekuga ja tehnika automatiseerimisega on kerge rakendada ka pikkade DNA ahelate, sealhulgas mõnede tervete geenide puhul. See meetod põhineb dideoksünukleotiidide ahela lõpetamisel PCR-i pikenemisreaktsioonide käigus.
Sangeri meetod
Sangeri meetodis kasutatakse matriitsina analüüsitavat DNA ahelat ja PCR-reaktsioonis kasutatakse DNA polümeraasi, et genereerida praimereid kasutades täiendavaid ahelaid.
Valmistatakse neli erinevat PCR-i reaktsioonisegu, millest igaüks sisaldab teatavat protsenti dideoksünukleosiidi trifosfaadi (ddNTP) analoogidest ühele neljast nukleotiidist (ATP, CTP, GTP või TTP). Uue DNA ahela süntees jätkub seni, kuni üks neist analoogidest on sisse lülitatud, mille käigus ahel on enneaegselt kärbitud.
Lõpptulemusena sisaldab iga PCR-i reaktsioon, mis sisaldab erineva pikkusega DNA ahelaid, mis kõik lõpevad nukleotiidiga, mis selle reaktsiooni jaoks oli dideoksükomärgisega märgistatud. Seejärel kasutatakse geeli elektroforeesi, et eraldada nelja reaktsiooni ahelad neljas eraldi rööbastes ja määrata algse malli järjestus, lähtudes sellest, milliste pikkustega sirgud lõpevad, millise nukleotiidiga.
Automatiseeritud Sangeri reaktsioonis kasutatakse praimereid, mis on märgistatud nelja värviga fluorestsentsmärgisega. PCR-reaktsioonid erinevate dideoksü-nukleotiidide juuresolekul viiakse läbi nii, nagu eespool kirjeldatud. Järgnevalt kombineeritakse neli reaktsioonisegu ja kantakse ühele geelile. Iga fragmendi värv tuvastatakse laserkiire abil ja informatsioon kogutakse arvuti abil, mis genereerib kromatogrammid, millel on iga värvi piigid, millest saab kindlaks määrata matriits-DNA järjestuse.
Tavaliselt on automatiseeritud sekveneerimismeetod täpne ainult nende järjestuste korral, mille pikkus on maksimaalselt umbes 700-800 aluspaari. Kuid on võimalik saada suuremaid geene ja tegelikult kogu genoomi täisjärjestusi, kasutades samm-samaseid meetodeid, nagu Primer Walking ja Shotgun sekveneerimine.
Primer Walking'is töödeldav osa suuremast geenist järjestatakse Sangeri meetodil. Uued praimerid genereeritakse usaldusväärsest järjestuse segmendist ja kasutatakse järjestuse jätkamiseks selle geeni osa kohta, mis jäi algsete reaktsioonide vahemikust kaugemale.
Püstolümpade järjestus tähendab, et huvipakkuvat DNA-segmenti juhtivalt lõigatakse sobivamate (juhitavate) suurusega fragmentideni, iga fragmendi järjestamine ja kattuvate järjestuste rajamine tükkide kaupa. Sellist tehnikat on hõlbustanud kattuvate tükkide paigutamiseks mõeldud arvutitarkvara rakendamine.