Milline PCR on seotud DNA järjestamise ja võimendava geeniga
Polümeraasi ahelreaktsioon ( PCR ) on molekulaarne geneetiliseks meetodiks geeni mitmekordsete eksemplaride valmistamine ja see on osa geeni järjestamise protsessist.
Kuidas toimib polümeraasi ahelreaktsioon?
Geenikoopiad tehakse DNA-valimi abil ja tehnoloogia on piisavalt hea, et teha mitu eksemplari proovist leitud geeni ühes eksemplaris. Geeni PCR-amplifitseerimine miljonite koopiate tegemiseks võimaldab geenijärjestuste tuvastamist ja tuvastamist, kasutades visuaalseid tehnikaid, mis põhinevad DNA tüki suurusel ja laengul (+ või -).
Kontrollitud tingimustes genereeritakse väikesed DNA segmendid ensüümidena, mida nimetatakse DNA polümeraasideks, mis täiendavad deoksünukleotiide (dNTP-d) DNA-tükile, mis on tuntud kui "mall". Polümeraasi lähtepunktiks on isegi väiksemad DNA tükid, mida nimetatakse "praimeriteks". Praimerid on väikesed keemilised DNA tükid (oligomeerid), tavaliselt 15 kuni 30 nukleotiidi pikkune. Neid valmistatakse lühikeste DNA järjestuste teadmisega või ettekujutamisega võimendatava geeni väga otstes. PCR-i ajal sekveneeritakse DNA-d ja kaksiksidemed eraldatakse. Pärast jahutamist seonduvad praimerid malliga (nn lõõmutamine) ja loovad aluse polümeraasi jaoks.
PCR-tehnika
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) oli võimalik termofiilide ja termofiilsete polümeraasi ensüümide (ensüümid, mis säilitavad struktuuri terviklikkust ja funktsionaalsust pärast kuumutamist kõrgel temperatuuril) avastamiseks.
PCR meetodi etapid on järgmised:
- Segu on loodud DNA malli, polümeraasi ensüümi, praimerite ja dNTP-ide optimaalse kontsentratsiooniga. Võimalus segu kuumutada ensüümi denatureerimisel võimaldab DNA proovi kahekordse heliprotsendi denatureerimist temperatuuridel vahemikus 94 ° C.
- Denatureerimise järel jahutatakse proovi mõõdukamale vahemikule, umbes 54 kraadi, mis hõlbustab praimerite anniilimist (seondumist) üheahelalise DNA matriitsiga.
- Tsükli kolmandal etapil kuumutatakse proov uuesti temperatuurini 72 ° C, ideaalseks temperatuuriks Taq DNA polümeraasi jaoks pikenemise jaoks. Pikenduse ajal kasutab DNA polümeraas originaalset DNA üksikut ahelat mallina, et lisada iga praimeri 3 'otsadesse komplementaarseid dNTP-sid ja luua huvipakkuva geeni piirkonnas kaheahelalise DNA osa.
- Praimerid, mis on lõastatud DNA järjestustele, mis ei ole täpne vaste, ei lõpe anniiliga 72 kraadi juures, piirates seega huvipakkuva geeni pikenemist.
See denatureerimise, anniilimise ja pikenemise protsess kordub korduvalt (30-40) korda, suurendades seeläbi eksponentsiaalselt soovitud geeni koopiate arvu. Kuigi see protsess oleks käsitsi teostamisel üsna tüütu, võib proove valmistada ja inkubeerida programmeeritavasse Thermocyclerisse, mis on enamus molekulaarlaboratooriumides praegu tavaline ja täielikku PCR-i reaktsiooni saab läbi viia 3-4 tunni jooksul.
Iga denatureerimisetapp peatab eelmise tsükli pikendamisprotsessi, lühendades seega uue DNA ahela ja hoides seda ligikaudu soovitud geeni suuruse ulatuses.
Pikendamistsükli kestust saab sõltuvalt huvipakkuva geeni suurusest muuta pikemaks või lühemaks, kuid lõpuks PCRi korduvate tsüklite kaudu, enamus malle piirdub vaid huvipakkuva geeni suurusega, kuna need on saadud mõlema praimeriga toodetest.
Eduka PCR-i jaoks on mitmeid erinevaid tegureid, mida saab tulemuste tõhustamiseks manipuleerida. Kõige laialdasemalt kasutatav meetod PCR-produkti olemasolu kontrollimiseks on agaroosgeel-elektroforees . Seda kasutatakse DNA fragmentide eraldamiseks suuruse ja laengu alusel. Seejärel visualiseeritakse fragmente värvide või radioisotoopide abil.
Evolutsioon
Pärast PCR-i avastamist on avastatud teisi DNA-polümeraase kui originaal Taq. Mõnel neist on parem "korrektuur" võime või nad on stabiilsemad kõrgematel temperatuuridel, parandades seeläbi PCR-i spetsiifilisust ja vähendades vigasid ebakorrektse dNTP sisestamisel.
Mõned PCR-i variandid on välja töötatud spetsiifilisteks rakendusteks ja neid kasutatakse praegu molekulaarsete geneetilistes laborites regulaarselt. Mõned neist on reaalajaline PCR ja reverse-transcriptase PCR. PCR-i avastamine on kaasa toonud ka DNA järjestuse, DNA-sõrmejälgede ja muude molekulaarsete meetodite väljatöötamise.