Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) reaktsiooni mis tahes komponendi kohandamine võib muuta tulemuse kvaliteeti, parandades või vähendades toote saaki ja kvaliteeti või parandades reaktsiooni spetsiifilisust ja tundlikkust. Lõpptulemuset mõjutavad parameetrid võivad olla kas füüsikalised (st temperatuur, tsükliajad) või kemikaal (st membraani kontsentratsioon, kasutatud ensüümi tüüp). Järgnevad on mitmed võtmetegurid, mis mõjutavad PCR edukust.
01 Puhta laboratoorsed tingimused
Kuna PCR on võimeline tuvastama ühe DNA molekuli, on oluline, et laboris säilitataks põlised tingimused. Kandke alati värske kindaid, kasutage steriilset klaasnõud, torusid ja pipetiotste ja steriilseid lahuseid ning puhastage tööalast enne töö alustamist.
Alati tuleb lisada kontrollreaktsioone ilma mallita DNA-d ja ensüümi ilma, et tulemused oleksid tõepoolest õige valimi paranemise tõttu.
Enamikul inimestel on kindel, et neil on oma lahenduste kogum, mida ei leidu, et teha tõrkeotsingu lihtsamaks ja määratud pipeteeritakse sageli ainult PCR-i jaoks. Dnaasi ja RNaasi vaba PCR-katseklaasid, aerosooli-vastupidavad pipetiotsad ja ultraviolettkiirgusega suitsugaasi kattekiht on ka probleemide vähendamiseks.
02 Keemilised komponendid
- On 18 kuni 24 alust
- Kas pole teisest struktuuri (st juuksenõelaga silmuseid)
- G / C ja A / T paaride tasakaalustatud levik
- Ei ole täiendavad üksteist 3-suu lõpus
- Kas sulatamistemperatuur (Tm) on ligikaudu 5-10 kraadi Celsiuse allanenud keetmistemperatuuril, mis on tavaliselt vahemikus 55 kuni 65 kraadi Celsiuse
Mõlema praimeriga Tm peaks ka parimate tulemuste saavutamiseks olema sarnane.
03 Reaktsioonisegu: mall ja praimerid
Optimaalne praimeri kontsentratsioon on vahemikus 0,1 kuni 0,6 mikromooli / L. Malli suurus varieerub sõltuvalt DNA tüübist (inimese, bakteriaalne, plasmiid).
Malli väga väikeste koguste korral on tulemuste parandamiseks ka teisi strateegiaid, nagu tsüklite arvu suurendamine või "kuuma algus" kasutamine. Katsetage alati uusi positiivse kontrollreaktsiooniga praimereid, et olla kindel, et need töötavad teie konkreetsetel katsetingimustel.
04 Reaktsioonisegu: ensüümide aktiivsus
MgCl2 kontsentratsioon reaktsioonisegust võib mõjutada PCR-i tulemust ja võib olla olulisem roll veelgi keerulisemates reaktsioonides. Magneesiumi katioon moodustab dNTP-de abil lahustuvaid kompleksid, et saada tegelikku substraati, mida polümeraasi ensüüm tunneb ära.
Kõik nelja dNTP-d võrdsed kogused aitavad ka vähendada polümeraasi veamäära. Teatavad lisaained nagu betaiin, BSA, detergendid, DMSO, glütserool ja pürofosfataas võivad samuti mõjutada ensüümi spetsiifilisust või reaktsiooni efektiivsust.
05 Thermocycleri tüüp
Kui ostate laboriseadmeid, pidage silmas, et mõned termotsüklid on täpsete soovitud temperatuuride säilitamisel vähem täpsed kui teised.
See on üks valdkond, kus odavlennufirmad ei kaota pikemas perspektiivis, kui sul on silmapaistev reaktsioon või kasutatakse praimereid, mis nõuavad kerge aurutamistemperatuuri.
Thin-seinaga reaktsiooninumbrid, mis sobivad teie kasutatava termotsükleri täpse kaubamärgi jaoks, aitavad samuti optimeerida reaktsioonitemperatuure.
06 tsükli seaded
Suurema saagikuse saavutamiseks on võimalik pikendada iga 20 tsükliga pikendamise aega, et kompenseerida vähem ensüüme enamate mallide võimendamiseks. Tavaliselt on vähem kui 40 tsüklit piisav, et amplifitseerida vähem kui 10 matriitsmolekuli kontsentratsioonile, mis on piisavalt suur, et seda vaadata etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelil .