Valgu puhastamise meetodid

Oluline osa biotehnoloogiaalastest teadusuuringutest on kasutada proteiinitehnikatehnikaid konkreetsete tööstuslike rakenduste jaoks optimaalsete omadustega valkude kavandamiseks või muutmiseks. Selleks peavad teadlased olema võimelised isoleerima ja puhastama huvipakkuvad valgud, et uurida nende konformatsioone, substraadi eripära, reaktsioone teiste ligandidega ja konkreetseid tegevusi.

Vaja on proteiinisisalduse määr sõltuvalt valgu kavandatavast lõppkasutusest.

Mõnede rakenduste puhul on toores ekstrakt piisav. Kuid muuks otstarbeks, näiteks toiduainetes ja farmaatsiatööstuses, on vaja puhtust kõrgel tasemel. Selle saavutamiseks kasutatakse tavaliselt mitmeid puhastusetappide seerias valku puhastamismeetodeid.

Iga valgu puhastamise etapp annab tavaliselt toote kaotuse teatud määral. Seetõttu on ideaalne valguspuhastusstrateegia see, kus puhastamistase saavutatakse kõige väiksemates etappides. Kasutatavate etappide valik sõltub sihtvalgu suurusest, laadimisest, lahustuvusest ja muudest omadustest. Üksiku tsütosoolse valgu puhastamiseks on kõige sobivamad järgmised meetodid. Tsütosoolsete valkude komplekside puhastamine on keerulisem ja nõuab tavaliselt erinevaid meetodeid.

Valguse puhastamise esimesed sammud

Esimene samm rakusisese (raku sees) valkude puhastamisel on puhastamata ekstrakti valmistamine .

Ekstrakt sisaldab raku tsütoplasma kõigi valkude ja mõnede täiendavate makromolekulide, kofaktorite ja toitainete segu. Tooret ekstrakti võib kasutada mõnes biotehnoloogia rakenduses, kuid kui puhtus on probleem, tuleb järgida järgnevaid puhastusetappe.

Toorvalgu ekstraktid valmistatakse raku lagunemise abil, mis on tekkinud rakkude lüüsimisel ja mis saavutatakse kemikaalide ja ensüümide , ultrahelitöötluse või prantsuse pressi abil. Prügi eemaldatakse tsentrifuugimisega ja supernatant eraldatakse. Rakuvälistest valkudest saadud toorainetest võib saada rakkude lihtsalt eemaldamise teel tsentrifuugimisega.

Teatavate biotehnoloogiliste rakenduste jaoks on olemas nõudlus termostabiilsete ensüümide järele : ensüümid, mis suudavad taluda kõrgeid temperatuure ilma denatureerimiseta ja säilitades samas suure spetsiifilise aktiivsuse. Neid toodavaid organisme nimetatakse mõnikord äärmofiilideks. Kuumakindlate valkude puhastamiseks on lihtne läheneda teiste segude valgude kuumutamisele kuumutamisel, seejärel lahuse jahutamisel (võimaldades seega termostabiilset ensüümi vajadusel muuta või uuesti lahustada). Denatureeritud valke võib seejärel eemaldada tsentrifuugimisega.

Vaheühendi puhastamise etapid

Varem oli toorekstrakti valgu puhastamiseks tavaline teine ​​etapp sadestamisega kõrge osmootse tugevusega lahuses (so soola lahused). Toorekstrakti nukleiinhappeid saab eemaldada streptomütsiinsulfaadi või protamiinsulfaadi abil moodustunud agregaatide sadestamisega.

Valgu sademete saamiseks kasutatakse tavaliselt soola ammooniumsulfaati.

Erinevad valgud sadestuvad ammooniumsulfaadi erinevates kontsentratsioonides. Üldiselt ammooniumsulfaadi madalamate kontsentratsioonide korral sadestub suurema molekulmassiga valke. Soolade sademed tavaliselt ei vii väga puhastatud valku, vaid võivad aidata mõne soovimatute valkude kõrvaldamiseks segus ja proovi kontsentreerimisel. Seejärel eemaldatakse lahuses olevad soolad dialüüsiga läbi poorse tselluloosi torustiku, filtreerimise või geelist eralduva kromatograafia.

Kaasaegsed biotehnoloogiaprotokollid kasutavad sageli mitmeid kaubanduslikult saadaval olevaid komplekte, mis pakuvad standardsete protseduuride jaoks valmis lahendusi. Valgu puhastamine viiakse läbi sageli filtrite ja valmistatud geelfiltreerimise kolonnidega. Kõik, mida peate tegema, on järgida juhiseid ja lisada õige lahendus õigele mahule ja oodata kindlaksmääratud ajavahemikku eluanti kogumisel (mis väljub kolonni teine ​​ots) värskes katseklaasis.

Allikad:

Zubay G. 1988. Biokeemia, 2. väljaanne. Macmillan Publishing Co, New York, NY, USA.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Valgu puhastamise käsiraamat, väljaanne AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.