Vaja on proteiinisisalduse määr sõltuvalt valgu kavandatavast lõppkasutusest.
Mõnede rakenduste puhul on toores ekstrakt piisav. Kuid muuks otstarbeks, näiteks toiduainetes ja farmaatsiatööstuses, on vaja puhtust kõrgel tasemel. Selle saavutamiseks kasutatakse tavaliselt mitmeid puhastusetappide seerias valku puhastamismeetodeid.
Iga valgu puhastamise etapp annab tavaliselt toote kaotuse teatud määral. Seetõttu on ideaalne valguspuhastusstrateegia see, kus puhastamistase saavutatakse kõige väiksemates etappides. Kasutatavate etappide valik sõltub sihtvalgu suurusest, laadimisest, lahustuvusest ja muudest omadustest. Üksiku tsütosoolse valgu puhastamiseks on kõige sobivamad järgmised meetodid. Tsütosoolsete valkude komplekside puhastamine on keerulisem ja nõuab tavaliselt erinevaid meetodeid.
Valguse puhastamise esimesed sammud
Esimene samm rakusisese (raku sees) valkude puhastamisel on puhastamata ekstrakti valmistamine .
Ekstrakt sisaldab raku tsütoplasma kõigi valkude ja mõnede täiendavate makromolekulide, kofaktorite ja toitainete segu. Tooret ekstrakti võib kasutada mõnes biotehnoloogia rakenduses, kuid kui puhtus on probleem, tuleb järgida järgnevaid puhastusetappe.
Toorvalgu ekstraktid valmistatakse raku lagunemise abil, mis on tekkinud rakkude lüüsimisel ja mis saavutatakse kemikaalide ja ensüümide , ultrahelitöötluse või prantsuse pressi abil. Prügi eemaldatakse tsentrifuugimisega ja supernatant eraldatakse. Rakuvälistest valkudest saadud toorainetest võib saada rakkude lihtsalt eemaldamise teel tsentrifuugimisega.
Teatavate biotehnoloogiliste rakenduste jaoks on olemas nõudlus termostabiilsete ensüümide järele : ensüümid, mis suudavad taluda kõrgeid temperatuure ilma denatureerimiseta ja säilitades samas suure spetsiifilise aktiivsuse. Neid toodavaid organisme nimetatakse mõnikord äärmofiilideks. Kuumakindlate valkude puhastamiseks on lihtne läheneda teiste segude valgude kuumutamisele kuumutamisel, seejärel lahuse jahutamisel (võimaldades seega termostabiilset ensüümi vajadusel muuta või uuesti lahustada). Denatureeritud valke võib seejärel eemaldada tsentrifuugimisega.
Vaheühendi puhastamise etapid
Varem oli toorekstrakti valgu puhastamiseks tavaline teine etapp sadestamisega kõrge osmootse tugevusega lahuses (so soola lahused). Toorekstrakti nukleiinhappeid saab eemaldada streptomütsiinsulfaadi või protamiinsulfaadi abil moodustunud agregaatide sadestamisega.
Valgu sademete saamiseks kasutatakse tavaliselt soola ammooniumsulfaati.
Erinevad valgud sadestuvad ammooniumsulfaadi erinevates kontsentratsioonides. Üldiselt ammooniumsulfaadi madalamate kontsentratsioonide korral sadestub suurema molekulmassiga valke. Soolade sademed tavaliselt ei vii väga puhastatud valku, vaid võivad aidata mõne soovimatute valkude kõrvaldamiseks segus ja proovi kontsentreerimisel. Seejärel eemaldatakse lahuses olevad soolad dialüüsiga läbi poorse tselluloosi torustiku, filtreerimise või geelist eralduva kromatograafia.
Kaasaegsed biotehnoloogiaprotokollid kasutavad sageli mitmeid kaubanduslikult saadaval olevaid komplekte, mis pakuvad standardsete protseduuride jaoks valmis lahendusi. Valgu puhastamine viiakse läbi sageli filtrite ja valmistatud geelfiltreerimise kolonnidega. Kõik, mida peate tegema, on järgida juhiseid ja lisada õige lahendus õigele mahule ja oodata kindlaksmääratud ajavahemikku eluanti kogumisel (mis väljub kolonni teine ots) värskes katseklaasis.
- Kromatograafilisi meetodeid saab rakendada pink-top-kolonnidega või automaatse HPLC-seadmega. HPLC-ga eraldamine võib toimuda pöördfaasi, ioonvahetuse või suuruse välistamise meetodite abil ning proovid tuvastatakse dioodireadete või lasertehnoloogia abil. The
Valgu visualiseerimine ja puhastamise hindamine
- Pöördfaasi kromatograafia (RPC) eraldab valgud nende suhtelise hüdrofoobsuse alusel . See meetod on väga selektiivne, kuid nõuab orgaaniliste lahustite kasutamist. Mõned valkud on lahustite abil püsivalt denatureeritud ja kaotatakse funktsionaalsust RPC ajal. Seetõttu ei ole see meetod kõigile rakendustele soovitatav, eriti kui see on vajalik, et sihtvalk säilitaks aktiivsuse.
- Ioonivahetuskromatograafia tähendab valkude eraldamist laengu põhjal . Kolonnid võivad olla valmis anioonivahetuseks või katioonivahetuseks. Anioonivahetuskolonnid sisaldavad positiivse laenguga statsionaarset faasi, mis meelitab negatiivselt laetud valke. Katioonivahetuskolonnid on vastupidine, negatiivselt laetud helmeste, mis meelitavad positiivselt laetud valke. Sihtvalgu (de) elueerimine viiakse läbi, muutes pH väärtust kolonnis, mille tulemusena muutub või neutraliseeritakse iga valgu laetud funktsionaalrühmad.
- Suuruse eraldamise kromatograafia ( geelfiltratsioon ) eraldab väikestest valgudest suuremaid molekule, kuna suuremad molekulid kromatograafiakolonnis ristseotud polümeeri kaudu kiiremini reisi saavad. Suured valkud ei sobi polümeeri pooridesse, samas kui väiksemad valgud teevad kromatograafiakolonni kaudu läbimiseks vähem aega otsetee kaudu. Eluaat kogutakse torude seeriasse, mis eraldavad valgud elueerimisaja alusel. Geli filtreerimine on kasulik vahend valguproovi kontsentreerimiseks, kuna sihtvalk kogutakse väiksemas elueerimismahus kui see, mis esialgu lisati kolonni. Suuremahulise valgutootmise tõttu on nende kulutõhususe tõttu võimalik kasutada sarnaseid filtreerimismeetodeid.
- Afiinsuskromatograafia on väga kasulik meetod valgu puhastamise protsessi "poleerimiseks" või valmimiseks. Kromatograafiakolonni helmed ristsiduvad ligandide külge, mis seonduvad spetsiifiliselt sihtvalguga. Seejärel eemaldatakse valk kolonnist, loputades lahused, mis sisaldavad vabasid ligandeid. See meetod annab puhtaimad tulemused ja kõrgeima spetsiifilise aktiivsuse võrreldes teiste meetoditega.
- SDS-PAGE on polüakrüülamiidgeellektroforees, mis viiakse läbi SDS-i (naatriumdodetsüülsulfaat) juuresolekul, mis seondub valkudega, andes neile suurt negatiivset laengut. Kuna kõigi valkude tasud on suhteliselt võrdsed, siis eraldab see meetod peaaegu täielikult suuruse järgi. SDS-PAGE-d kasutatakse sageli valgu puhtuse testimiseks pärast iga järjestikuse etapi lõppu. Kuna segus järk-järgult eemaldatakse soovimatud valgud, väheneb SDS-PAGE geelil visualiseeritavate ribade arv, kuni ainult soovitud valku on esindatud.
- Immunoblottimine on valkude visualiseerimise meetod, mida kasutatakse kombinatsioonis afiinsuskromatograafiaga. Spetsiifilise valgu antikehad kasutatakse afiinsuskromatograafia kolonnis ligandina. Sihtvalk säilub kolonnis, seejärel eemaldatakse kolonni loputamisega soolalahusega või muude ainetega. Radioaktiivsete või värvimärgistega seotud antikehad aitavad sihtvalku tuvastada, kui see on eraldatud ülejäänud segust.
Allikad:
Zubay G. 1988. Biokeemia, 2. väljaanne. Macmillan Publishing Co, New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Valgu puhastamise käsiraamat, väljaanne AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.